科學家威廉.佛斯特(基努.李維 飾演)受雇私人非政府組織研究機構，從事將剛死亡人類的意識，轉移到機器人的電子腦中，藉由機器人讓人死而復活。
這天緊急轉移凱利中士的意識，他搞不清楚自己為何會變成機器人，在實驗室自殘，工作人員制止反遭攻擊，混亂中威廉將凱利中士機器人連接電腦的電源線拔掉，實驗再次宣佈失敗。
他的主管瓊斯（約翰·歐提茲 飾演）提醒威廉這是第345次失敗，若再交不出成功作品，出資老闆將結束所有研究。
威廉向瓊斯保證會在週休兩天裡找出問題點。
威廉跟研究助理艾德（湯瑪士·米德迪奇 飾演 ）借了遊艇，要帶家人搭遊艇出遊渡週末。往港口途中下起大雨，道路彎道多加上視線不良，險象環生。
他的妻子莫娜（艾莉絲·伊芙 飾演）問他太危險就不去港口了，威廉對自己的駕駛技術很有信心，下個轉彎差點與迎面而來的大卡車相撞，緊急煞車後，他轉頭詢問妻兒情況時，驚見莫娜被倒下並穿透前擋風玻璃的樹幹穿過腹部，慌亂中威廉竟將車開向路標衝下河流，發生嚴重撞擊。
不知昏迷多久威廉醒來後，察看莫娜，坐後座的大女兒索菲、兒子馬特，他最疼愛的小女兒佐依全身亡。
驚慌失措後他趕緊打電話給艾德，讓他帶機器趕來出事地點，艾德看到躺在岸邊的四人頻呼老天，威廉拜託艾德錄下四人腦部記憶，然後用他正在進行的研究培養出複製人。
艾德堅稱自己只複製過羊跟狗貓等動物，人，不敢貿然嘗試，而且複製人是違法的。更何況培養槽設備是公司財產，不能擅自使用。
威廉懇求艾德幫忙，他不能失去妻兒，只是要家人活過來而已。
艾德心軟了，答應回公司搬培養槽，問題來了，培養槽只有三套，要捨棄其中一人。經過一夜流淚思考，威廉痛下決心放棄復活小女兒佐依。
他們兩人在威廉家地下室展開複製人培養，需要不間斷的龐大電力，威廉偷來幾條街的所有汽車電瓶，這起汽車電瓶失竊案，還引來警察上門盤問。
威廉裝病在家守護培養槽，一邊消除佐依的生活用品，一邊替妻兒回覆手機電腦裡同學朋友的訊息。
瓊斯對威廉稱病不來上班很不爽，聽煩了艾德編的肺炎扁桃腺發炎病況，直接闖威廉家給予最後警告。
莫娜和索菲跟馬特的複製人完成，多次模擬都無法成功轉移腦部記憶，和瓊斯通電話時，威廉意外發現大腦無法識別金屬身體，記憶無法認同身體，實驗才會一直失敗。他大膽將妻兒的腦部記憶直接存入複製人中，等待他們甦醒。
威廉回去上班，告訴艾德這重大發現，再送來新的捐贈者時，威廉冒險以長針刺進瞳孔將自己的記憶錄下儲存，艾德看見他流血的眼睛罵他瘋了。
第二天早上威廉看見活生生的莫娜在廚房準備早餐，驚喜莫名，索菲，馬特一前一後走進來嚷肚子餓，威廉開心的為他們做煎蛋土司。
索菲打開牛奶發現酸掉了，懷疑經過一晚牛奶就壞，也記不得昨天晚餐吃了什麼？更找不到手機。
威廉安慰他們那些都是小事，別在意。
莫娜發現衣櫥有佐依的簽名，問威廉那是誰？他說出一切真相。車禍，死亡，複製人。
莫娜問威廉：「你為什麼要這麼做?」威廉回答：「因為我愛妳!」
瓊斯發現了威廉成功複製出死去的家人，派出大批保鑣要帶走莫娜三人，因為使用的是公司的設備跟技術，複製人自然是公司的財產。
在追逐逃跑爭執打鬥過程，整起事件出現大逆轉。
威廉在實驗室和瀕死的瓊斯達成協議後，帶著妻兒離開。成功轉移威廉記憶的345號機器人，將將受槍傷垂死瓊斯的記憶轉移到複製人上。
兩人聯手經營將垂死之人的記憶轉移到複製人身上，藉以延長人類生命的生意。
另一邊威廉帶著復活了的佐伊來到沙灘和莫娜，索菲，馬特會合。
《捍衛生死線》重點不是複製人，而是在最親愛家人突然身亡後，不想天人永隔，要他們活回來，劇情不是〈禁入墳場〉的驚悚血腥，而是基努.李維的親情取捨，只有三套培養槽，只能四選三，必須放棄一個人的親情掙扎，無奈的選擇。
經過層層波折後編導給基努.李維一個完美結局，稍稍彌補他真實人生中的諸多缺憾。
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–西伯利亞
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